对虾属节肢动物门(Arthropoda)，甲壳纲(Crustacea)，十足目(Decapoda)，对虾科(Penaeidae)，对虾属(Penaeus)，是重要的经济养殖虾类。我国沿海对虾养殖曾是出口创汇的支柱产业，但近年来由于病毒性流行病的暴发，使得对虾养殖业遭受了巨大的损失，对虾病毒病的防治已成为迫在眉睫的攻关课题。 由于病毒没有独立的新陈代谢系统，必须借助于活的组织细胞才能培养分离出来，所以需要建立细胞系以供病毒的分离纯化，并进行各种病毒特性的研究。一些国家已建立了主要养殖鱼类的许多细胞系，可作为这些鱼病毒性传染病的检测工具。然而，对虾细胞培养难度很大，且从事此研究的学者也不多，目前国内外报道已建立的细胞系只有几个，还只是有限细胞系，并没有成为商品细胞。因而急需找出较为适宜的培养基，来成功地进行对虾体外细胞培养。 本研究选取日本对虾具有解毒功能的肝胰腺和具有免疫机能的血细胞来培养，摸索最适的培养条件，研究促进细胞生长的因素，为建立对虾细胞系奠定基础。利用离体培养细胞可以研究对虾病毒的侵染机制，从而更加有针对性地进行对虾病毒病的防治。 动物组织培养(细胞培养)始于20世纪初，到1962年规模开始扩大，发展至今已成为生物、医学研究和应用中广泛采用的技术方法。利用细胞培养，生产具有重要医用价值的酶、生长因子、疫苗和单抗等，已成为医药生物高技术产业的重要部分。水产动物的细胞培养是从20世纪60年代以后发展起来的，用于病毒的分离和纯化，对水产动物的疾病防治具有重要意义。
1 研究进展
Peponnet和QUlOt(1971)首先报道了螯虾和龙虾的类淋巴组织、性腺和心脏等组织的体外培养，Patterson和Steward(1974)培养了美洲龙虾和美洲鲎的血细胞，Daig和Spindler(1979)培养了小龙虾的上皮细胞。以上均为原代细胞培养。Chen等(1986)首先将斑节对虾的卵巢组织细胞传至第3代，Hu等(1990)将中国对虾肝胰腺组织传代培养28代，王立平等(1996)将中国对虾甲壳下上皮细胞传代培养25代。国内外学者对蓝对虾、凡纳对虾、印度对虾、短沟对虾和罗氏沼虾等的卵巢、肝胰腺、心脏和胚胎等进行了组织培养。Hsu等(1995)对斑节对虾Oka器官(淋巴组织)细胞的各种培养条件进行了全面的研究，并建立了世界上第1个对虾细胞系，这是对虾组织培养研究工作的一个重大突破。但只传了90代，未能无限传代生长，因而只是有限细胞系。 笔者的实验室曾进行了日本沼虾血细胞的原代和传代培养及其肝胰腺的原代培养。并在此基础上研究了免疫增强剂(IED)对原代血细胞的影响，金属离子Cu2+和Zn2+对传代血细胞碱性磷酸酶(AKP)和总磷含量的影响。结果表明：
1)渗透压为470 mmol／kg时，原代血细胞的贴壁状况良好。此时测得的碱性磷酸酶的相对活力较大，说明此渗透压有利于细胞的代谢。
2)免疫增强剂在体外对血细胞的激活作用，是在浓度高出一定值时才表现出来。在低浓度时，对血细胞的酚氧化酶及超氧化物歧化酶有轻度的抑制作用。
3)加适量维生素C可促进悬浮细胞贴壁，加适量葡萄糖可促进细胞生长。培养液中加入微量的Cu2+可提高日本沼虾传代血细胞碱性磷酸酶的活性。Zn2+在一定浓度时对碱性磷酸酶活力无显著影响，但传代血细胞中总磷含量较高，细胞生长较好。
2 培养方法
2.1 培养环境
细胞培养要求的无菌条件极严格，通常在无菌培养室、无菌操作箱和超净工作台内进行，培养基和所用器械均需严格灭菌。
2．2 培养基
2．2．1 培养基的成分
用于动物细胞培养的人工合成培养基有Tcl99、1640、Eagle's、MEM、Grace昆虫培养液和L-15等．水产动物的细胞培养所用培养基多在上述合成培养基的基础上又添加一些天然成分，如小牛血清等。小牛血清对组织培养起着相当大的作用，血清质量好可以促进细胞贴壁和生长，还可以保护细胞免受脂肪酸和金属离子蛋白酶等物质的损害．小牛血清采取56 C灭活1 h，可以破坏血清中非特异抑制物，并且可防止支原体污染。对于一些较难培养的细胞可增加一些特殊的营养成分，如糖类、氨基酸、维生素、矿物离子和一些条件培养基及细胞生长因子等。
2．2．2 渗透压
如何确定平衡盐的浓度，主要看组织或细胞在该溶液中的状态．等渗情况下细胞舒展，结构完整，核清晰可见。否则，细胞萎缩或肿胀。不同的培养对象要求稍有差异。
2．2．3 抗菌素
培养基中加入一定量的抗菌素是必需的。一般加青霉素100U／mL、链霉素100 g／mL，或再加两性霉素B为0．1 g／mL，以便防止细菌和霉菌的污染。
2．2．4 温度
对虾为变温动物，其细胞培养温度依培养种类不同而异。虾类一般以25～28℃为宜，对虾肌肉组织原代细胞培养在26℃较好。
2．2．5 酸碱度(pH值)
根据测定所培养动物体液的pH值来决定培养基的酸碱度，用NaHCO3和稀HCl调节pH值，一般为6．8～7．2。pH值过高或过低时，细胞生殖率显著下降．最好在CO2培养箱中培养，供给CO2的体积分数为5％。
2．3 供培养组织的处理
供培养的组织要经过严格的擦洗、消毒与多次冲洗．对虾细胞还需用体积分数为70％的乙醇或二氯化汞等再处理，以杀灭海洋中一些弧菌类有机体。
2．4 接种方法
将处理好的组织用剪刀细剪成很碎的小块，加入少量培养基调成糊状，接种于细胞瓶(板)壁。
3 应用前景
3．1 医药业
许多海洋动物的细胞可以用来生产昂贵的药物，不少海洋动物能合成抗癌、抗病毒和抗心血管病的药物。若能查明这些动物的哪类细胞能合成药物，便有可能用细胞培养法来生产这些药物。
3．2 病毒研究
建立海洋无脊椎动物的细胞系是当前国际上的攻关课题，对虾的组织培养研究已于1994年列入国家海洋攀登B计划。组织培养技术是研究病毒学的基础。建立细胞株(系)以供病毒的分离、纯化，并进行各种特性的分析，为进一步研究单克隆抗体奠定基础。培养对虾的免疫细胞是研究对虾免疫机能和筛选免疫增强药物的手段，从而为解决虾病防治问题开辟一条有效途径。
3．3 细胞学研究
细胞短期培养可获得大量处于中期的分裂相，以便进行染色体分析。还可以观察活细胞的分泌活动，分析分泌物的化学性质，以及显示内分泌腺的分泌物对靶器官的作用等。
3．4 渔业生产
对虾组织和细胞培养技术可望应用于遗传育种，利用细胞融合与杂交技术，培育出新品种，将会促进对虾养殖业的发展。 综上所述，对虾的组织培养研究将会提高病毒学、免疫学、遗传学和细胞工程学等学科的研究水平，并将进一步促进医药业和渔业的发展。不断成熟的动物细胞大规模培养技术不仅在生产药用蛋白方面，而且在基因治疗、基因疫苗用的病毒载体的生产、人工器官和组织移植用分化细胞的培养等研究领域都具有广阔的应用前景。
扩展阅读
罗氏沼虾概述
一、概述
罗氏沼虾又名马来西亚大虾、淡水长臂大虾，是一种大型淡水虾，原产东南亚。它具有生长快、食性广、肉质营养成份好，以及养殖周期短等优点。自本世纪60年代开始人工养殖罗氏沼虾以来，发展迅速，现东南亚国家和其他一些地区养殖此虾比较普遍。我国自1976年引进此虾，现已在广东、广西、湖南、湖北、江苏、上海、浙江等十多个省市自治区进行养殖，一般亩产可达70～100公斤，取得了明显的经济效益。
二、形态特征
（一）外观形态
罗氏沼虾躯体肥壮、短粗。全身分为头胸部和腹部。头胸部粗大，腹部自前向后逐渐变小，末端尖细。雄虾个体大于雌虾，雄虾第二步足特别发达，长度超过体长，颜色鲜艳，显得格外壮观。
水域透明度小，体色则深。罗氏沼虾具有鲜艳的体色和随环境条件变化而变化的特性。
有时在池中缓慢游泳。具明显的负趋光性，白天多呈隐蔽状态，活动较少，但在投饵时照样觅食。夜间活动较为频繁，觅食产卵均在夜间进行，因此在夜间捕捞往往比白天好。
罗氏沼虾活动的强弱与外界环境的变化有关，特别是对水温、水流及水中溶氧量等的变化，反应极为敏感。当水温下降到18℃时，活动减弱;16～17℃时，反应变迟钝，持续一定时间即会冻死。当注入新水时便朝着新水方向集群游泳，甚至游到进水口逆水而上;当水中溶氧低时可造成浮头，并集群攀缘于岸边，反应迟钝，严重时跳于堤岸，不久将会窒息死亡。
四、食性
罗氏沼虾属杂食性动物，随着不同的生长发育阶段，其要求的食物组成是不同的。在人工饲养条件下，刚孵出的幼体主要以丰年虫幼体为食，经4、5次蜕皮后个体逐渐长大，可以摄食鱼肉碎片、鱼卵、蛋黄等以及其它细小的动物性饵料，经过淡化处理后的幼虾则转化为杂食性，主要以水生昆虫幼体、小型甲壳类、水生蠕虫、其它动物尸体以及有机碎屑、幼嫩植物碎片为食。成虾阶段食物更杂，动物性饵料有水生昆虫、软体动物、蚯蚓、小鱼、小虾以及各种动物尸体;植物饵料有鲜嫩的水生植物、着生藻类、谷物豆类等。在饥饿和放养密度大的情况下，还以同类为食，这对蜕壳虾来说，危害是比较大的。罗氏沼虾的摄食量有着明显的季节变化，主要受水温的变化影响。水温20～30℃，摄食旺盛;水温18℃以下，摄食量减少
五、生长
刚孵出的幼体长1.7～2.0毫米，营浮游生活。经24～35天培育，脱皮11次，变态为稚虾，体长可达7～9毫米，转为淡水栖息生活。体长达3～4厘米的幼虾，经过4～5个月的饲养，雄体长达31厘米以上，体重80克左右;雌体长10厘米以上，体重在40克左右。若将越冬后的幼体(体长5～6厘米)在春天放养，到年底雌虾可达体长13～14厘米，体重60～70克，雄虾可达体长17～18厘米，体重200克。
六、生殖习性
在自然条件下，一冬龄的罗氏沼虾达性成熟。在人工养殖条件下达到性成熟的最小个体，雌体长7厘米，体重12克左右;雄体长10厘米，体重25克左右。性成熟的雄虾第二步足特别发达，粗而长，呈蔚蓝色。生殖孔开口于第五步足基部，性成熟的雌虾第二步足较小，呈浅蓝色，腹部较发达，侧甲延伸形成抱卵腔，用以附着卵。生殖孔开口在第三步足基部。性腺位于头胸甲的背部，性成熟时，通过透明的头胸甲背面近胃区可以见到橙黄色的卵巢和乳白色的精巢。雌虾在产卵前要脱一次壳，称生殖脱壳。脱壳前活动减弱，对阳光反应迟钝，摄食明显减少。雌虾脱壳后几小时开始交配，此时，雄虾主动接近雌虾，并守护在雌虾旁边，不让其它虾靠近，雌虾行动迟缓，不久就开始产前脱壳，脱壳后，雄虾兴奋地举头竖身，不停地摆动触须，并伸出强有力的大螯，呈抱雌虾状态，并连续跳动，几分钟后，便将雌虾抱住，并把雌虾抱举起反转位置，胸腹部紧紧相贴，游泳足不断地拍击，很快就完成了交配过程。射出的精液成块状附着于雌虾胸腹部的附肢之间，由一层薄的胶状物包住。雌虾在交配后数小时开始产卵，多在夜间进行。产卵时对光线反应迟钝，时而将背部隆起，腹部呈屈伸动作，并在水中上下翻动，忽而卷曲身体，忽而伸直腹部微微向前游动，产卵过程一般持续4～5小时。产出的卵粘在携精块的刚毛上，此时精荚散放出精子，精卵结合完成受精过程，腹部侧甲延伸形成抱卵腔，用于保护受精卵，未受精卵在1～3天内自行脱落。
罗氏沼虾的卵为中黄卵，充满着卵黄，随着胚胎发育，卵径由0.5～0.6毫米增加到0.6～0.7毫米;卵色由橙黄色依次变为淡黄、淡灰，最后变为瓦灰色。罗氏沼虾属一年产卵多次的一次性产卵类型，两次产卵间隔为30～40天。怀卵量随个体大小、营养水平而异，由几千到数万粒不等。
七、脱皮和变态习性
刚孵出的罗氏沼虾称为蚤状幼体。这是罗氏沼虾整个生命周期中唯一在咸淡水中度过的生活阶段，在此期间，幼体在一定的温度、盐度、溶氧量和饵料等适宜的生活条件下，历时一个月左右，经过11次脱皮后变态成仔虾。变态时间随水温和饵料的条件而异。从稚虾开始转为底栖生活，摄食底栖生物和有机碎屑。
当有90%以上的幼体变为稚虾后，即应把稚虾移出进行淡化处理，使其逐步适应淡水生活。稚虾经过淡化处理后，即可移入培育池进行强化培育，当稚虾平均规格达到2.5厘米左右即为幼虾。幼虾经过暂养达到3～4厘米即可作为虾种用来进行成虾养殖。
罗氏沼虾幼体发育共分为十二期，各期的交递是通过脱皮实现的，每进行一次蜕皮后幼体就出现新的形态构造特征，使幼体发育逐步完善。这个发育期的主要形态特征见表2。
表2罗氏沼虾幼体各期的主要形态特征
八、营养价值
根据对罗氏沼虾的营养成分分析，其可食部分含蛋白质20.5%，脂肪0.48%，水分77.8%，蛋白质含量与对虾（20.6%）相当，而比常见的草鱼（17.9%）、鲤（18.1%）等食用鱼类都高。
罗氏沼虾营养成分与海养对虾相当，而虾壳厚，附肢粗，可食部分比对虾少。但罗氏沼虾适宜在沿海和内陆养殖（而对虾只能在沿海养殖），养殖区域宽，可以就近活体应市，鲜活度高，运销成本低，市场售价相应也低于海养对虾，因而大受欢迎，销量也大。
国内外对南美白对虾营养需求的研究情况介绍
南美白对虾蛋氨酸tb)在南美白对虾维生素营养方面作了较多研究。他们首先以添加全价维生素预混料的饲料为对照组，从全价的维生素预混料中分别除去其中一种维生素作为实验组，初步研究氨基苯甲酸、维生素B1、B2、B6、泛酸钙、烟酸、生物素、叶酸、B12、氯化胆碱、肌醇和Vc【以L一抗坏血酸一2一磷酸酯的形式加入)等12种水溶性维生素对白对虾的影响．养殖l4天后，缺乏Vc的实验组成活率比对照组低25％；不添加维生素B1或B2的实验组，对虾生长率显著
低于对照组，其余各组则差异不显著而从第15到31天，所有实验组对虾的成活率都显著低于对照组(He等，1992a)。在另一个实验中，He等(1992b)研究了南美白对虾对脂溶性维生素A、D、E、K的需求，发现A、D、E是白对虾所必需的，而
维生素K是非必需的。He和Lawrence(1993a)进一步研究证明vc对于提高南美白对虾成活率至关重要，缺乏Vc，存活率显著降低，而且体重小的比体重大的更为敏感。根据存活和增重结果得出．0．1g左右的稚虾，饲料中vc的最低需要量为
120mg／kg，随着体重的增加，饲料中vc的添加量可以适当降低。He和Lawrence(1993b)研究维生素E需要量时发现，饲料中添加维生素E显著促进白对虾生长，但当含量达到100mg／ks时，增重则不再有明显的差异，因此南美白对虾维生素E的需要量推荐为100rog／kg。
5、矿物质元素
矿物质对虾类营养也十分重要，虽然对虾能从水环境中通过鳃、体表、肠等壹接吸收矿物质，但在集约化养殖模式下远远不能满足需要，许多元素必需从饲料进一步中得到补充。然而，矿物质在饲料中添加过多又会引起对虾慢性中毒，矿物质元素过量可抑制酶的生理活性、污染水环境，而且在虾体通过富集作用而危害人体健康，因此，饲料中添加矿物质元素必需慎重，要选择利用率高的剂型，要弄清对虾的最适需要量。【1)Ca与PDavis等(1991)研究表明，南美白对虾商业饲料中添加ca是不必要的，ca的添加反而会抑制P的吸收利用。而饲料中添加P对于南美白对虾生长相当重要Davis和Arnold(1994)研究P的消化吸收率时发现南美白对虾对不同P源中P的利用率差异很大：磷酸二氢钙，46．3％；磷酸氢钙，19．1％；磷酸钙，9．9％；磷酸二氢钾．68．1％；磷酸二氢钠，68．2％。因此，建议饲料厂家在成本允许的前提下，可考虑使用磷酸二氢钾或磷酸二氢钠作为P源，这样可降低水环境中的P污染，对于南美白对虾健康、可持续养殖是很重要的。
(2)^IgMg是多种酶的辅基和激活剂。L和Lawrence(1996)报道南美白对虾M的需要量为012％反映出南美白对虾对ME有较高的需求。如果南美白对虾经淡化后淡水养殖，饲料中Mg的添加量还应适当提高。
(3)ZnDavis等(1993)推荐南美白对虾zn需要量为110mg／ks。许多研究表明，水产动物对氨基酸螯合态Zn盐的利用率要比无机态的高得多(比如Tan和Mai，2001；Paripatananont和Lovel1．997；李爱杰等，1995)。若南美自对虾饲料添加氨基酸螫合态的zn盐，则zn需要量可以显著降低。
(4)和MⅡDavis等(1992)的研究表明，南美白对虾商业饲料中不需要添加Fe。Liu和Lawrence(1997)报道南美自对虾饲料中不需要添加Mn。
(5)CaCu是对虾血蓝蛋白的组成成分，同时也是多种酶包括细胞色素氧化酶、酪氨酸酶、抗坏血酸酶和酚氧化酶的成分，影响体表色素形成、生殖系统和神经系统的功能，同时影响对虾的非特异性免疫。刘发义等(1990，1991)报道南美自对虾cu的需要量为53mg／kg，进一步添加会导致cu在肝胰脏的大量积累；Davis等(1991)研究表明，
34mg／kg的cu足以满足南美白对虾的需要，但当cu含量达到120mg／kg时也没有表现出副作用飞禧特水产科技公司(2000)的研究表明，对虾对蛋氨酸螯合cu的利用能力比硫酸铜高出一倍以上。(6)Co刘发义等(1990，1991)报道饲料中c0含量50—70mg／kg时，南美白对虾增重率最高。飞禧特水产科技公司(200o)的研究表明，对虾对蛋氨酸螯合co的利用能力比氯化钴高出一倍以上。
(7)se是有毒元素，又是动物生命活动所必需的元素。根据Davis等(1991)的研究结果，对虾饲料中se的添加量推荐为0．2—0．4mg／kg
6、免疫增强剂
尽管免疫增强剂不是对虾必需的营养素，但如果在饲料中适量添加好的免疫增强剂，往往可以取得意想不到的效果：既能提高成活率又能显著促进生长，同时减少抗生素类药物的用量，有利于对虾养殖业的健康发展研究表明，B一葡聚糖、岩藻聚糖等都能提高对虾的免疫力，其中B一葡聚糖还能提高增重30％以上，感染白斑病毒后延缓死亡20—30天
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