实验研究FSH对体外培养支持细胞的DDX4和TPX1表达情况的影响,为深入研究体外精子发生提供理论和实践依据。以培养的犊牛支持细胞为实验材料,共以不同浓度FSH(0、0.01、0.02、0.04、0.08IU/mL)处理支持细胞,3个时间点的DDX4和TPX1的表达情况通过Realtime-PCR被检测。下面具体来了解一下！FSH对体外培养犊牛支持细胞DDX4和TPX1基因表达的影响。
支持细胞间的紧密连接形成血睾屏障，血睾屏障又将精细管的生精上皮分为基底小室和近腔小室两个部分，由于两个小室之间拥有不同的微环境，所以可以影响不同阶段的生精细胞发育，基底小室完成生精过程的启动阶段，内含精原细胞和细线期的精母细胞，近腔区靠近精细管的管腔一端，完成减数分裂使生精细胞向成熟精子变形，其中有正在发育的生精细胞和精子细胞。另外，FSH和睾酮等激素通过支持细胞对调节精子发生起到重要作用。DDX4和TPX1是生精细胞产生，他们均是精子发生的必要蛋白。关于他们是否在支持细胞表达还鲜有报道。
本实验体外培养支持细胞，通过FSH的作用，探讨几种与精子发生作用的重要基因变化，即DDX4和TPX1，为体外精子发生研究提供理论和实践依据。
1、材料
犊牛睾丸来双城市屠宰场，4h内运送回实验室．DMEM(Gibco)；PBS(Solarbio)；乙二胺四乙酸二钠(Amresco)；胰蛋白酶(1：250，Amresco)；FSH（宁波第二激素厂）；Trizol试剂（哈尔滨英俊生物技术有限公司）；FastStartUniversalSYBRGreenMaster(Rox)（德国罗氏公司）；EasyTaq酶、PrimeSTARHS(Premix)、DNAMarker、dNTP、oligodT引物、各种内切酶和RNaseInhibitor(宝生物工程(大连)有限公司）；ImPromIIreversetranscriptase（Promega公司）；2×TaqPCRMasterMix(北京天根公司)。
2、方法
2..1支持细胞制备
犊牛睾丸组织为试验材料，利用胶原酶和胰酶的组合酶法将其解离成单细胞悬液，并采用差速贴壁法纯化支持细胞后进行体外培养，支持细胞纯度大于95%。
2..2FSH处理支持细胞
解冻并培养支持细胞，初始细胞密度为3．O×10-4个／mL。将不同浓度FSH随机分为五组，A组，0.OlIU／mLFSH;B组，0.02IU／mLFSH;C组，0.04IU／mLFSH;D组，0.08IU/mLFSH,CK组(Controlcheck)OIU/mLFSH.
2..3细胞收集
以3．O×104个／mL的密度将支持细胞接种到多个6孔板，将细胞孔分为五组，每组9孔细胞。6h细胞贴壁后分别更换为5种不同浓度FSH培养基，空白组更换为全培养基，并以此时记做Oh。在6h、12h、24h时，分别向各组3个待测孔加1mLTrizol，吹打数次，收集细胞移入1.5mLEP管中，-80℃保存。
2..4DDX4和TPX1基因的相对定量
根据Trizol说明书提取各组细胞总RNA。总RNA经检测分析合格后进行反转录。反转录按照PromegaImpromII(Promega，Madison，WI，USA)试剂盒说明书两步法进行操作。为了检测FSH对基因表达的调节能力，通过RealtimePCR测定DDX4和TPX1的表达量，应用引物序列见表1。引物均由北京华大基因生物技术有限公司合成。
3、讨论与分析
3.1
FSH对支持细胞中DDX4基因表达的影响
DDX4基因为哺乳动物生殖细胞特异表达基因，与精子发生减数分裂密切相关，从减数分裂前就开始表达，在DDX4基因被敲除的纯合突变小鼠中，精子发生受阻于第一次减数分裂前期的偶线期，细胞凋亡，不能产生精子，显然在小鼠精子发生中偶线期的顺利完成有赖于DDX4基因的表达。实验检测FSH处理后支持细胞中DDX4基因mRNA表达量，结果一定浓度的FSH能够促进DDX4基因mRNA的表达增加。同时，支持细胞的紧密连接将曲细精管的基底区和近腔区处于不同的微环境中，近腔区是经减数分裂产生单倍体细胞，所以支持细胞有可能够通过FSH作用产生DDX4参加减数分裂促进精子发生，并且DDX4可能是近腔区微环境中的减数分裂因子。
3.2FSH对支持细胞中TPX1基因表达的影响
TPX1是在雄性生殖道中特异性表达的富含半胱氨酸的分泌蛋白，在睾丸特异性表达，有关于TPX1生物特性报道指出，TPX1的mRNA在生精细胞粗线期精母细胞有表达，并持续表达到成形精子形成，同时TPX1蛋白也持续进行表达，TPX1可以做为精母细胞和其他防治细胞功能联系的分子桥梁。本实验表明不同浓度的FSH处理支持细胞后TPX1表达量均显著提高，推测支持细胞产生的TPX1参与支持细胞与生精细胞的连接和功能传递，并进一步影响精子的发生。
4、结论
在一定浓度范围内，FSH显著促进DDX4、TPX1基因的表达，DDX4在12h左右表达量最高，TPX1在24h左右表达量最高。
相关知识
代乳粉对早期断奶犊牛生长及健康的影响
犊牛的培育是奶牛养殖业的关键环节，加强犊牛培育是提高牛群质量和生产水平的一项重要措施。我国大多数养殖场在犊牛培育上采用传统的养殖模式，即用鲜牛奶饲喂犊牛，一般犊牛自出生到断奶约需要消耗牛奶350～450kg，占奶牛年产奶量的5%～10%，由于鲜奶市场供不应求，用鲜奶培育犊牛成本高昂，因此很多养殖场选用病牛奶、抗生素奶饲喂犊牛，但这样又会导致犊牛感染疾病或对抗生素产生抗药性。近年来，世界各国对奶牛代乳粉开展了广泛的研究，用代乳粉饲喂犊牛，犊牛采食代乳粉，不仅可以早期断奶，而且可以产生一系列的积极效应，如节省鲜牛奶、降低饲养成本、促进犊牛消化器官的发育等等。奥氏代乳粉是根据犊牛的消化特点设计的，它以优质的植物蛋白为载体，配以充足的维生素和微量元素以及血球蛋白粉、低聚糖等免疫因子，经特殊加工工艺制成。为验证代乳粉的实际饲喂效果，特进行本次试验。
1试验材料与方法
本试验2008年3月～2008年5月在银川市平吉堡奶牛原种繁育场进行。
1.1试验材料
1.2试验动物的选择
1.3试验动物的饲养
将30头犊牛随机分组，独笼饲养，犊牛出生3d内饲喂全初乳，3～7d饲喂常乳。试验组8～30日龄开始添加饲喂一定比例的奥氏犊牛代乳粉（饲养方法见表3），对照组8～30日龄全部饲喂常乳6kg。通过对犊牛增重及发病情况的记录，计算出每头牛的日增重和净增重以及每组犊牛的平均日增重和发病率。将2组进行比较，看差异是否显著，如不显著，则说明代乳粉可有效代替常乳饲喂犊牛，并且不影响犊牛正常的生长发育。试验时间为30d。
1.4犊牛代乳粉的使用方法
1.4.1代乳粉的过渡
从喂初乳或牛奶向喂代乳粉过渡期为3～4d，避免突然改变日粮引起胃肠的不适应。方法是：第一天，代乳奶占1/4、牛奶3/4；第二、三天代乳奶和牛奶各占1/2；第四天代乳奶占3/4、牛奶占1/4；从第五天开始即全部喂代乳奶。
1.4.2代乳奶的配制方法
按1∶8的比例用60℃左右的温水冲调，但不可用开水，否则会使脂肪和蛋白质变性而致使犊牛难以消化，反而产生腹泻并降低犊牛的生长发育速度。
1.4.3代乳奶的饲喂方法
待混合好的代乳奶自然降温到37℃左右时，用小盆分发给每头犊牛，每天3次（做到定时，定温，定量），保证每头犊牛准确饲喂，不偏喂、少喂。
1.5试验牛的管理
试验牛从7日龄时开始训练采食精料（精料配方见表4），至30日龄1.5kg/d/头，必须保证充足的饮水。
1.6测定指标
犊牛出生重，30日龄体重，采食情况，精神状态，犊牛疾病发病情况等。
2结果与分析
2.1犊牛代乳粉对犊牛体增重的影响
试验开始对照组平均体重为39.4kg，试验组犊牛平均体重为39.6kg，试验组与对照组犊牛初生重差异不显著（p0.05）。经过30d的代乳粉饲养试验，对照组平均体重为56.6kg，试验组平均体重为59kg。由此可以看出，用营养平衡且完善的犊牛代乳粉代替常乳的确不影响犊牛的正常生长发育。经t检验，试验组与对照组差异不显著（p0.05），试验组比对照组平均体重多2.4kg，且试验组平均日增重比对照组要多0.071kg，这说明奥氏代乳粉能够有效代替常乳饲喂犊牛，易于消化，且有利于犊牛生长。
2.2犊牛的发病情况
在30d的试验期间，两组牛均发生拉稀现象，试验组3头与对照组4头犊牛发生腹泻，并无明显差异；试验组1头犊牛食欲不振是因为对代乳粉配制方法不熟悉和饲喂操作不规范所致；试验组2头犊牛和对照组1头犊牛发生感冒均属天气突变引起，与代乳粉无关。
2.3犊牛代乳粉对犊牛饲养经济效益的分析
由表6可以看出，试验组每头犊牛30d比对照组每头犊牛可节约人民币91.4元，按照试验组饲喂代乳粉0.75kg/d头、对照组饲喂常乳6kg/d头计算，预计到60日龄断奶可节约饲养成本248.9元/头，15头犊牛共节约了3733元。在当前奶价不断上涨的情况下，使用代乳粉势在必行，在保证犊牛正常生长发育的前提下可大大节约犊牛培育所需的成本，能够为企业获得更多的经济效益。
3结论
经过30d的饲喂试验，试验组犊牛比对照组犊牛平均日增重多0.071kg，这表明用配制营养完善的犊牛代乳粉完全可以替代鲜牛奶饲喂犊牛，犊牛代乳粉的确不影响犊牛的正常生长发育，而且在预防犊牛腹泻上效果良好，有利于犊牛的健康生长。
从经济效益分析的角度来看，进食代乳粉组犊牛比对照组到60日龄断奶可节约饲养成本248.9元/头（鲜奶按3元/kg计算）。以平吉堡奶牛原种场为例，共有成母牛550头，预计每年可产母犊300头，仅犊牛培育可节约饲养成本74670元。由此可见，奶牛养殖场利用犊牛代乳粉采取犊牛60日龄早期断奶势在必行，必然会为企业创造丰厚的效益。
投饵次数和投饵量对鳖饵料效率的影响
1、投饵次数和投饵量：习惯认为给鳖投饵应在上午8时左右，下午6时左右，2次为宜。主要理由是：
（1）鳖一般在上午日出后1～2小时到日落前喜到岸上晒背，这段时间不宜投饵。
（2）鳖虽具有夜间活动的本性，在自然界以夜间摄食为主，但在露天池中夜间温度低，还是在白天温度较高时投饵好。
（3）鳖喜静怕惊，人频繁出入池边对鳖是一种威胁，见人逃窜时会把饵料带到水中，造成浪费，再者考虑到劳动量，所以1天2次投饵是比较科学的。
鳖摄食量变化规律是：随着个体长大，单位体重的摄食量逐步减少，以人工配合饲料（干重）为例，在最适温度范围内，稚鳖阶段每天的投饵率为体重的6％～8％，幼鳖3％～5％，成（亲）鳖一般2％～3％即足够。每天饵料量的分配，一般为上午投喂总量的40％，下午投喂60％。
2、生长量与投饵量的修正：由于对鳖的摄食习性不了解，或者为了追求高生长率和产量，往往“投饵不足”或“投饵过量”。尤其是后者，不仅浪费了饵料，还会增加水质管理的难度和发病几率。从理论上讲，当饵料系数为3.0时，所产生的水质管理和发病率问题，将是饵料系数为2时的150％以上。可见寻求鳖的最好生长率和饵料效率之间最理想的平衡——最适投饵量，具有重要的实践意义。根据经验最适投饵量大致为鳖饱食量（一次正常投饵，鳖停止摄食前所能吃掉的饵料量）的90％左右为最适投饵量，这样不仅能使饵料效率得到充分发挥，也可以减轻水质管理难度和降低发病率等。
营养对奶牛产奶量和乳成分的影响
人们对牛奶品质的要求不断提高，因此奶牛场在提高产奶量的同时还要考虑改善牛奶的品质。奶牛饲料添加剂的研究也日趋增加，但多以微量元素和维生素以及瘤胃调节产品为主。如何提高奶牛日粮蛋白质的利用效益，减少氮的排放是提高奶牛养殖效益的重要手段。实际养殖生产中影响奶牛产奶量和乳成分的因素很多，主要有品种、环境、管理、营养、疾病、生理状况等。下面我们就一起来看看营养对奶牛产奶量和乳成分的具体影响！
1、碳水化合物
碳水化合物包括非纤维碳水化合物和纤维。其中非纤维碳水化合物包括淀粉、糖和果胶。在配制奶牛的日粮时非纤维碳水化合物占日粮于物质的比例应为20%-45%。此范围是根据日粮中精粗料的比例来确定，对于粗料含量较少的日粮，非纤维碳水化合物要求为40%～40%。饲喂适量的非纤维碳水化合物可以有效的改善牛奶的品质，不但可以提高乳脂率还可以提高乳蛋白率。如果过度饲喂则会使乳蛋白率和乳脂率都下降。因此每次饲喂谷物类饲料时要注意限制饲喂量，以防止发生瘤胃酸中毒、牛奶品质下降、奶牛食欲不良而引起产奶量下降的问题。
奶牛以采食粗饲料为主，因此纤维对奶牛的瘤胃健康、产奶量以及乳成分有着重要影响作用，纤维的含量可刺激瘤胃发酵和唾液的分泌，保持牛奶中正常的乳蛋白和乳脂肪量非常的重要。因此要保证奶牛日粮中最低酸性洗涤纤维为19%～21%，中性洗涤纤维最低为25%～28%，如果低于以上水平，则会导致奶牛出现乳脂率低、酸中毒、体况不佳。但是要注意粗纤维的比例也不宜太高，否则影响牛奶中乳蛋白的含量。一般要求饲喂400/～50%的粗饲料即可，如果粗饲料的饲喂量高于65%，则要选择优质的粗饲料，以免引起乳蛋白下降。除此之外，纤维的长度也很重要，要保证饲料足够的粒度，不可切的过短，或粉的过细，牧草不应短于1cm，否则会引起乳脂率的急剧下降。
2、蛋白质
奶牛的产奶量是随着日粮中粗蛋白含量的增加而增加的，高产奶牛对蛋白质的需要量超过了瘤胃蛋白质的合成量。因此，有的养殖场在养殖高产奶牛时，在泌乳早期会提高日粮中粗蛋白质含量至17.5%，这其中过瘤胃蛋白的量占35%-37%。但是奶牛的产奶量也并不是无限增加的，如在使用棉籽作为粗蛋白质的补充物时，随着日粮中粗蛋白含量的增加，产奶量和乳脂率增加，当粗蛋白含量超过17.5%以后，产奶量几乎就不再增加。另外，蛋白质补充物的添加形式不同，产奶量和乳脂率也不同。例如，使用压碎的大豆可提高乳脂率，而使用大豆粕可以提高产奶量，而乳脂率不受影响。奶牛日粮中可降解蛋白和过瘤胃蛋白的量对于产奶量和乳成分有重要的影响作用。一般要求瘤胃可降解蛋白和过瘤胃蛋白应占日粮中总蛋白质的65%，如果过少会降低产奶量和牛奶中营养物质的含量。过瘤胃蛋白的营养作用对于提高奶牛的产奶量和乳成分很重要，但是在添加时要注意所添加的过瘤胃蛋白质所含有的氨基酸是否能与机体所缺的氨基酸匹配，否则即使增加了饲料中过瘤胃蛋白质的量，但是由于机体所需的氨基酸增加量不多，或者根本没有增加，也不会起到提高产奶量和乳成分的作用。
3、脂肪
对于高产奶牛来说在泌乳初期和中期会出现能量负平衡的现象，能量很难满足奶牛的需求，此时为了提高日粮中的能量水平，同时还不减少日粮中纤维浓度的情况下，可以采用添加脂肪的方式来提高日粮的能量浓度。这是因为脂肪可降低微生物的活性以及纤维素的消化率，所添加过瘤胃保持脂肪或惰性脂肪在瘤胃内不发生水解可直接进入小肠被消化吸收，因此，既可以起到提供能量的作用，也可避免影响其他营养物质的消化吸收。有研究表明，日粮中添加脂肪可以提高产奶量，但是乳蛋白率会降低，而添加植物性脂肪会降低乳脂率，添加惰性脂肪和过瘤胃保护脂肪则会提高乳脂率。
4、添加剂
实际生产中常使用一些饲料添加剂来提高奶牛的产奶量和改善乳成分。常使用的添加剂主要有保值性氨基酸。研究表明，日粮中添加保护性的蛋氨酸和赖氨酸可以提高乳蛋白，并且两者同时添加的效果要比单一添加好。
缓冲剂的添加可以缓冲高精日粮导致的瘤胃酸增多，尤其是对于高产奶牛来说，当饲喂低纤维、高谷物日粮时，添加缓冲剂可以提高产奶量和乳脂率。生产上常用的缓冲剂主要有碳酸氢钠、碳酸钠、氢氧化镁、膨润土等。
乙酸钠。乙酸是合成乳脂的主要成分，而粗纤维在瘤胃中降解会产生乙酸，这就是饲喂粗料型日粮的奶牛所产的牛奶中乳脂率高的主要原因。而对于高产奶牛来说，为了保持能量的摄入水平，粗饲料的饲喂量要相对的少一些，可通过添加乙酸钠的方式来起到提高乳脂率的作用。另外，乙酸钠的添加还对高温热应激起到一定的缓冲作用。
另外，一些微量元素的添加，如铜、锌、硒、碘的添加可以提高奶牛的产奶性能，对于提高乳蛋白、乳脂率也有一定的作用。
气候对蜜蜂的影响
(1)光
日照能刺激蜜蜂出动，采集季节为一年的长日照季节。蜂箱宜放阴凉处，巢门朝向一般为南，夜晚蜜蜂也有趋光现象，夜晚应处在黑暗环境。
(2)温度
蜜蜂属变温动物，单一蜜蜂在静止状态时，具有和周围环境极相近的温度。冬天群体蜜蜂彼此挤在一起，形成一个球形的蜂团以抵御严寒。气温在1440℃时蜜蜂进行工作。
(3)湿度
据测定，育虫箱内相对湿度稳定在35％一45％，蜜蜂扇风有助排湿，冬季是靠打开蜂房盖，从空气中吸收水分来解渴的，因此室内空气太干燥蜜蜂就会感到口渴。在自然条件下，温和湿这两个因素同时存在而且密切相关/。水分的蒸发提高了湿度而又降低了温度。此外，湿度还影响植物的泌蜜量和蜜汁蒸发及花粉的粘性，间接地对蜂蜜和花粉的采集起着影响。
(4)其他气候
因素蜜蜂生活要求流动新鲜的空气，当空气不流通，群蜂易显不安状态，特别闷热时更加危险。
阵雨或突然的曝晒对于蜜蜂出动安全亦有很大影响。海滨经常风大的地区，蜜蜂采集活动被迫贴近地面飞行，因此，选择场址对于风力、风向的频度以及小范围的天然屏障或人造屏障都必须加以注意。
牛卵丘卵母细胞体外成熟的研究方法及进展
随着胚胎工程技术的深入研究和商业化推广应用，牛卵母细胞体外成熟、体外受精技术成为解决体外生产胚胎紧缺问题的重要途径之一。本研究在总结前人研究的基础上，应用体外培养技术对牛卵母细胞体外成熟、体外受精及早期胚胎体外发育作了进一步研究，旨在建立健全一套完整的体外生产高产优质牛胚胎的高新技术体系，为胚胎工程和生产实践提供技术操作规程和方法，为理论研究积累资料。下面就具体来了解一下：牛卵丘卵母细胞体外成熟的研究方法及进展。
牛卵丘母细胞体外成熟是在牛体外模拟卵泡环境，进而诱发未成熟卵母细胞成熟的一项生物技术。其是牛体外受精（IVF）的基础，也是重要环节之一，牛卵丘卵母细胞的体外成熟质量直接影响其体外受精效果，甚至是影响出生牛犊的质量。本文就牛卵丘卵母细胞体外成熟研究现状、研究方法、体外成熟的判定和存在问题等进行论述。
1、研究现状
有关专家于1935年利用兔卵泡中分离出来的卵丘卵母细胞进行体外培养，经成功减数分裂后，完成了兔卵丘卵母细胞的体外成熟过程。此后，哺乳动物的卵丘卵母细胞体外成熟培养技术得到了迅猛发展。目前，卵丘卵母细胞的体外成熟技术已被广泛应用于科学研究、医学生殖工程和畜牧生产中。牛未成熟卵母细胞经体外培养，体外成熟率可达90%以上。然而，体外成熟卵母细胞的质量和发育潜能与体内成熟的卵母细胞相比仍有较大差距，体外成熟的卵母细胞存在细胞质成熟差或者细胞核和细胞质成熟并不同步等问题。针对目前牛体外受精研究中出现的问题，有关专家认为，牛卵丘卵母细胞在成熟过程中退化以及细胞质不完全成熟是造成其体外受精胚胎生产效率低的主要原因。
2、研究方法及进展
2.1牛卵丘卵母细胞的获得
2.1.1从废弃的牛卵巢中获得
即运用切割法或抽吸法等机械分离法从屠宰场废弃的牛卵巢上获取未成熟的卵母细胞。将收集卵巢置于25～35℃的生理盐水中，添加抗生素，3小时内运回实验室。将术者的手和母牛的卵巢消毒后，将卵巢上多余的肉割掉，用装有18号针头的5毫升注射器，从卵巢表面直径为2～6毫米卵泡中抽取卵母细胞，也可用消毒的手术刀片切割卵巢，回收卵母细胞。
此方法中卵巢保存温度对卵母细胞的质量影响较大，此方法获得的卵母细胞成本低，但由于淘汰的牛大多无系谱，难以做到良种化。
2.1.2应用牛活体采卵技术采集卵丘卵母细胞
牛活体采卵技术是继牛体外受精、胚胎移植（ET）技术之后研究并推出的又一项胚胎工程技术。牛的活体采卵技术于90年代后期开始研究，2001年，活体采卵、体外受精的牛胚胎移植后成功获得犊牛出生。此项新技术与IVF及ET技术的配套综合利用，将更充分地挖掘优良母牛的遗传潜力，缩短牛的世代间隔，扩大遗传背景清楚、价格低廉的胚胎来源，从而加速养牛业的遗传改良。同时，也可为牛的基因工程研究提供大量的试验材料，以促进动物基因工程研究迅速发展。
2.2活体采卵的方法
活体采卵的方法主要有盲采法、内窥镜法和超声波法。
盲采法完全依赖操作者的经验进行，采集结果不稳定，回收率低，且对卵巢和阴道组织损伤比较大，延长了采卵间隔，降低了采卵频率，因此限制了该技术的应用。
内窥镜法可直观、准确地对卵泡进行穿刺，对卵巢损伤很小，但对阴道穹隆损伤比较大，且设备复杂，操作繁琐。
超声波法借助B超采集卵母细胞，是最主要的活体卵方法之一。
3、牛卵丘卵母细胞体外成熟培养
牛卵丘卵母细胞的体外成熟首次由某位外国研究者完成，但这仅限于核的成熟。牛卵丘卵母细胞体外成熟的胚胎发育潜能直到1978年才通过体内受精获得犊牛证实。1986年，有关专家报道了牛卵母细胞经体外成熟及体外受精获得的试管犊牛，进一步确证了体外成熟牛卵母细胞的可行性。
3.1成熟培养液
目前，用于牛卵丘卵母细胞体外成熟的基础培养液多为TCM199，也有的使用Ham’sF-10，MEM，TALP等培养液。
3.2培养液中的添加物
3.2.1血清
血清中含有蛋白质、维生素、脂肪、激素、氨基酸等营养物质和多肽类因子，是卵丘卵母细胞体外成熟与受精所必需的物质，能有效提高牛卵丘卵母细胞的体外成熟率。随着研究的深入，人们了解到血清除了可以提供卵巢上卵泡体外生长所必需的营养物质以外，也存在抑制卵泡生长的因素。因此，近年来研究用牛血清白蛋白或白蛋白来代替血清添加到基础培养液中，起到很好的培养效果。
3.2.2激素
目前，绝大多数研究者在牛卵丘卵母细胞的体外成熟培养中添加促性腺激素或类固醇激素或两者的混合物，结果都对卵母细胞成熟起到了促进作用。培养液中添加激素能够刺激腔前卵泡的生长及腔的形成，并且抑制颗粒细胞的凋亡，而在无激素的培养液中卵母细胞成熟率显著降低，且退化量大大增加。
3.2.3生长因子
基础培养基中添加各种生长因子和细胞因子，如胰岛素、表皮生长因子、胰岛素生长因子、白血病抑制因子、转化生长因子等，对卵母细胞的生长、成熟可起到重要的调节作用。生产因子是卵母细胞成熟的诱导剂，能促进牛卵丘卵母细胞的体外成熟。
3.2.4卵泡液
卵泡液能够提高成熟卵母细胞质的质量，同时，控制卵泡液在培养液中的添加浓度，可以消除其对核成熟的抑制作用。有研究表明，卵泡液对核成熟的抑制作用与所采卵泡的大小有关。来自小卵泡（小于3毫米）和中卵泡（3～8毫米）的卵泡液抑制卵母细胞核成熟，大卵泡液（大于8毫米）对核成熟没有抑制作用。
3.2.5卵丘细胞
卵丘细胞能够增加卵母细胞内谷胱甘肽（GSH）含量，GSH具有促进精子穿卵、雄原核形成及提高组蛋白H1活性等功能。在卵丘细胞与卵母细胞之间存在间隙连接，一些小分子物质如离子、核酸、氨基酸等可在两者之间交换，进而促进卵母细胞成熟，卵丘细胞能促进卵母细胞体外减数分裂的恢复，并且对发生GVBD后至排出PB1也起着重要作用。
3.2.6钙离子
细胞内Ca2+可以使无活性的促进因子，处于激活状态，进而促进卵母细胞的成熟分裂。
3.3培养条件
3.3.1气相条件
体外培养一般采用含5%CO2的空气，或5%CO2、5%O2、90%N2的气体。培养系统内CO2不仅可以平衡培养基，而且还有助于细胞代谢中的丙酮酸转换成草酰乙酸，有利于细胞成熟。
3.3.2温度条件
不同的温度对卵母细胞体外成熟的影响很大，过高或过低的温度均不利于卵母细胞的体外成熟。牛卵母细胞一般采用39℃进行体外培养。
3.3.3湿度
对于湿度的调节，一般需在CO2培养箱内放置调湿盘，以维持99%～100%的相对湿度，防止因培养液蒸发改变培养基成分的浓度，影响pH值和渗透压。
4、牛卵丘卵母细胞体外成熟的判定
牛卵丘卵母细胞的成熟是涉及细胞核、细胞质、膜、卵丘细胞和透明带等成熟的复杂生物学过程。在形态上表现为纺锤体形成，核仁致密化，染色质高度浓缩形成染色体，第一极体释放，细胞器重组，以及卵丘细胞扩展、膨胀、液化和透明带软化等。近年来研究者借助光镜和电镜逐渐揭示出这一生理生化过程的形态结构变化。由于仅有核成熟和卵丘细胞成熟能在光镜下进行判定，而对卵母细胞的综合成熟过程很难做一整体的具有生理学意义的评价，因而现在主要是以卵丘细胞扩散，并释放出第一极体作为卵母细胞体外培养成熟的判定标准。
5、存在问题与展望
经过人们大量研究与探讨，牛卵丘卵母细胞的体外成熟技术逐渐被掌握，并得到了不断提高，同时也存在诸多问题，如卵母细胞体外成熟和早期胚胎发育阻滞，体外成熟卵母细胞的受精率较低，卵母细胞的成熟调控机理还不完全清楚等，但是，相信随着研究的不断深入，存在的问题会逐步被解决，同时，随着牛卵母细胞体外成熟技术的不断发展和完善，其必将推动牛体外受精技术的深入发展，并且，进一步促进核移植、外源基因导入和胚胎干细胞的研究，为促使牛胚胎操作技术的深入和牛体外受精胚胎商业化的普及，提供更有利研究和应用手段。
断奶应激反应对犊牛的影响
集约化养殖要求实行早期断奶。早期断奶不仅能够减少乳的消耗，还可以使犊牛更早适应固态饲料，加快功能性瘤胃的发育，为提高后继生产性能打下良好的基础。犊牛早期断奶后，从吮食母乳转向采食理化性状、气味及营养价值不同的干饲料，食物来源、形态、养分组成及饲喂形式的变化，对于消化道功能尚处于发育中的犊牛产生很大应激，表现为生长发育受阻、被毛杂乱、无光泽等。并且由于犊牛消化系统尚未发育完善，不能适应食物变化产生的应激反应，常常引起胰蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶等消化酶活性的降低并导致消化功能紊乱出现腹泻，对犊牛的健康生长不利。
1断奶应激对犊牛消化系统的影响
在对犊牛的断奶研究中发现，采食量是反映动物健康状态的一个重要的指标。断奶后，犊牛的采食量不足，并伴随着小肠绒毛膜萎缩，机体用于维持需要的能量增加与采食量的降低之间形成矛盾，伴随断奶应激。
母仔隔离、母乳的限量饲喂、饲料形态和环境的变更等都对犊牛的行为和生理造成应激。犊牛在断奶时，饲料形式和组成的改变主要表现在：出现暂时性的内分泌反应；胃肠道能量和蛋白质代谢可能会改变；采食和生长速度将会受到影响；瘤胃消化功能将会降低；动物的免疫系统可能会受到影响。有报道显示，断奶时，母仔分离使肉用犊牛体内外周血液中儿茶酚胺的浓度升高，肾上腺激素的浓度增高。与逐步断奶的肉用犊牛相比，突然断奶犊牛体内嗜中性细胞与淋巴细胞的比值升高。
2断奶应激对血液的影响
犊牛出现应激反应，血液中的某些成分会发生一系列的变化，可以作为检测应激的指标。但有的学者却认为不能完全把血液组分的变化作为检测应激的指标，不是所有的应激都会导致血液组分的改变。许多研究也采用了行为学的方法，通过观测正常行为与应激造成的不正常的行为变化对动物遭受的应激进行评定。在研究中采纳行为的变化和嗜中性细胞与淋巴细胞的比例作为检测应激的指标。有研究者对不同方式的母仔分离对犊牛的行为、血浆敏感蛋白浓度、嗜中性细胞与淋巴细胞的比值（N∶L）进行了研究。结果表明，母仔分离对犊牛是一种应激反应，应激反应常伴随着免疫功能的衰减和机体对疾病的易感性增强。骤然断奶对犊牛的体液免疫没有影响。在慢性应激中，细胞免疫能力衰退。细胞免疫可以作为5月龄内犊牛处于生理应激状态的指示指标。此外，在研究牛应激的过程中，大多采用肾上腺激素作为指示指标。此外有研究发现，血浆内皮质醇浓度和嗜中性细胞与淋巴细胞比值降低，白细胞含量、体外干扰素对促细胞分裂素及关键血清蛋白的反应，在断奶应激时出现极显著的变化。
3断奶应激对犊牛内分泌和免疫系统的影响
应激反应的实质是生理平衡的破坏与恢复过程，这一过程的实现主要依赖于交感神经与下丘脑～垂体～肾上腺反应轴的激活，并涉及一系列内分泌的调整，其中肾上腺所分泌的有关激素起到了重要作用。
激素对于犊牛的生存、应激～免疫系统的活化有重要的作用，可能会引起疾病的易感性增强。首先，下丘脑～垂体～肾上腺轴活化，导致肾上腺皮质分泌类固醇类激素和皮质酮，当感受到应激，在短短的几分钟内，皮质酮浓度的升高，可以持续数小时。类固醇是一种有效的肾上腺糖皮质激素。动物机体在感染状态、组织损伤的恢复阶段或在免疫反应的初期出现免疫抑制效应。动物体内调节生理应激的第二种方法是垂体一肾上腺轴的激活。从交感神经和肾上腺髓质层释放促肾上腺皮质素、肾上腺素和去甲肾上腺激素，当感觉到威胁或受到惊吓才会激活垂体一肾上腺轴，体内的白细胞携带～肾上腺受体，与肾上腺素或去甲肾上腺素结合。但有关免疫功能中神经递质生理作用的研究很少，主要由于这些神经递质在血液中含量甚微，样品的提取受到取样操作的影响，并且半衰期也很短。有文章对动物发生应激时，循环系统中嗜中性细胞和淋巴细胞数量的变化、T淋巴细胞和B淋巴细胞分化的减弱以及由于体内外应激因素的变化造成的白细胞表面的结合位点与大分子抗原的结合能力的改变等情况进行了综述。
4小结
当饲料形态和饲喂方式发生改变的时候，对犊牛会产生应激反应，犊牛的消化道内形态结构、消化酶的分泌和活性、体内应激敏感激素含量、血液中的一些组分会发生适应性的变化。通过了解犊牛断奶时这些指标的变化情况，可以对犊牛的应激状况进行评价，掌握犊牛的健康和生理状态，可以更加科学地减少断奶应激，从而更好地进行犊牛培育。
对猪品种生长激素（pGH）基因多态性的研究
本文在对猪品种生长激素基因多态性进行研究的同时，借助于PCR和测序技术，对11个猪品种的生长激素基因全序列多态性进行检测，43个SNPS和1个位于内含子3的7bp缺少片段被检测出，结果表明，猪品种之间的某种遗传分化在某种程度上不仅仅与地理的分布有关，同时和其基因的交流也有着直接性的关系。下面具体来看一下：对猪品种生长激素（pGH）基因多态性的研究。
猪生长激素主要是猪垂体前叶分泌的单链多肽类激素，对于猪的生长发育有着重要的调节作用。近些年来，猪品种生长激素基因多态性的研究始终成为科学界研究的重点之一。
1、材料和方法
样品来源和提取基因组DNA。选取11个品种的猪作为研究的对象，其中4头成华猪，4头大河猪，4头大河乌猪，5头杜洛克猪，6头长白猪，9头内江猪，6头荣昌猪，12头太湖猪，5头压雅南猪，5头约克夏猪，5头藏猪，共65个个体。基因组DNA的提取采取酚氯仿法。
PCR产物纯化、目的基因扩增以及序列测定。扩增pGH基因全序列和测序的引物采取Olig06.0软件进行，PCR反应试剂其反应体系的总体积则是50微升，其PCR反应的条件中温度控制为94℃，时间为10分钟；PCR产物借助于2.0%低熔点的琼脂糖凝胶进行回收。对其检测后的回收产物采取测序反应，反应产物经过醋酸钠纯化、干燥以及变性后，并借助于全自动序列分析仪分析其序列。
数据的分析。序列测定的结果在分析的过程中借助于DNAstar开始BLAST分析。对猪品种的核苷酸分歧度、净遗传距离以及品种内核苷酸多样度及逆行那个分析，猪品种间固定指数和其品种间的变异程度用Areliquin2.0软件包的分子方差进行分析。猪品种间PCH基因树构建的过程中采取Megaversion。
2、结果
猪品种生长激素基因SNPS分析。
猪品种生长激素基因的可靠序列总共有1960bp，含有内含子和外显子。43个SNPS和1个位于内含子3的7bp缺少片段被检测出，猪品种生长激素基因序列的变异种存在一定的转换偏倚现象。
猪品种生长激素基因单倍型。结果显示，65个序列中单倍型有55种，同时单倍型的多样度为0.997，其中大河乌猪、太湖猪、长白猪、藏猪以及雅南猪品种单倍型多样度高达1，而成华猪品种内单倍型多样度最低为0.5。
猪品种生长激素基因分子方差分析。分子方差分析结果表明，品种内方差组分为74%，而品种间方差组分占整个猪品种生长激素基因全序列总变异的27%，其品种间差异极为显著，P＜0.05。猪品种生长激素基因在猪的品种间存在明显的遗传分化，内江猪和成华猪、约克夏猪和荣昌猪、长白猪和大河乌猪以及藏猪和大河猪之间的生长激素基因结构差异相对不显著，P＞0.05，但是其他品种间生长激素基因结构差异较为显著，P＜0.05。
3、讨论
猪品种生长激素基因序列的多态性分析结果表明，生长激素基因全序列的一级结构中SNPSs位点较为丰富，同时PCR过程中，有着较小的错配可能性。pGH基因编码区其多肽中含有216个氨基酸，而其成熟的猪生长激素的蛋白中氨基酸的数量仅仅为191个。pGH蛋白的前导肽主要是以后总分子内的伴侣，调控着pGH生物活性在细胞内的转运和其定位，进而使得不同猪品种生长发育性能存在差异。猪品种生长激素基因自身进化过程和其品种的进化在内含子区均有体现，而猪品种之间的某种遗传分化在某种程度上不仅仅与地理的分布有关，同时和其基因的交流也有着直接性的关系。
4、结语
本文通过对猪品种生长激素基因多态性进行研究，研究总结出猪品种之间的某种遗传分化在某种程度上不仅仅与地理的分布有关，同时和其基因的交流也有着直接性的关系。
年龄对肉牛育肥的五种影响
1.对增重速度的影响。
年龄对增重速度的影响可分两种情况：一是生长与育肥同时进行，采用的是持续育肥法：二是生长与育肥分期进行，采用的是后期集中育肥法。在较高的营养水平情况下，肉牛在第一年即性成熟前生长最快，以后则生长速度减慢。所以在第一种情况下，增重速度也会随年龄的增加而渐减，第二年的增重量只有第一年的70%左右。在第二种情况下，前期以青粗饲料为主进行吊架子，故增重速度较慢，进入肥育阶段，在高营养水平的影响下，生长速度较快。体况较瘦的不同年龄的架子牛，在舍饲条件下进行充分饲养时，年龄较大的牛，因其胃容量较大而比年轻牛采食量大，因此，增重亦快于年轻的牛。
2.对增重经济的影响。
一般情况下，年龄小的牛增重1000克活重需要的饲料量比年龄大的牛要少，故年龄小的牛增重经济好于年龄大的牛。主要原因是：第一，年龄小的牛维持需要较少；第二，年龄小的牛体重增加的部分主要是肌肉、骨骼和内脏器官，年龄大的牛体重增加大部分是脂肪，从饲料转化为脂肪的效率大大低于饲料转化为肌肉和内脏等的效率，年龄小的牛机体含水量高于年龄大的牛。
3.对饲料总消耗量的影响。
在育肥期充分饲喂谷物及高品质粗饲料时，年龄小的牛每天消耗饲料少，但饲养期长，所以总耗料量多；而年龄大的牛，吊架子期采食粗料不作统计，育肥期采食量大，饲养期短，总耗料量少。
4.对放牧效果的影响。
放牧时年龄较小的牛，其增重速度低于年龄较大的牛，因此大牛放牧育肥的效果较好，而小牛则不理想。原因就是小牛的胃容量及消化能力小于大牛。
5.对投资效果的影响。
从投资方面考虑，饲养一二龄的牛比犊牛效果好，因为尽管购牛费用较犊牛高，但一二龄牛具有育肥期较短，育肥期间年消耗的精料占饲料消耗总量的比例小，以及资金周转快等优点，这就决定了购买一二龄的牛育肥比购买犊牛育肥的投资效果好。
总之，购买牛时，对年龄要慎重考虑。当计划采用快速肥育法（饲喂3～4个月便出售）时，则应选购一二龄的架子牛，而不宜选购犊牛；计划越冬后第二年出栏时，则应选一龄左右的牛，而不宜选购大牛，因为在冬季大牛用于维持需要的饲料太多，饲料报酬太低；当需要利用大量粗饲料、少量的精料时.即采用低精料长周期饲养制度时，选购二龄牛（粗饲料利用能力强）较犊牛有利。可见，选购育肥牛，把年龄和饲料效益、经济效益紧密结合在一起考虑是很有必要的。
